JHEP Reports|基因修复后iPSC用于治疗肝豆状核变性

基于iPSC的自体细胞治疗

（Shi, Y., et al. Nat Rev Drug Discov, 2017）

基于iPSC的自体细胞治疗

iPSC具有无限扩增的能力，并且可以分化为成体所有细胞类型，可为再生医学提供无限细胞来源。结合基因修饰技术，我们可以在获得病人自身的iPSC后，修复病人iPSC基因组中的突变，分化为疾病相关细胞类型，然后移植给病人（如上图）。

近期，作为
深港创新圈项目和
粤港科技创新联合项目的成果之一，香港大学（HKU）联合三启生物（CIB）/三启药物（CIT）和中国科学院广州生物医药与健康院（GIBH）在JHEP Reports上发表文章，提供了基因修复后iPSC用于治疗肝豆状核变性（也称威尔逊病，Wilson’s disease；WD）的概念验证数据。

▵ 项目概览

（Rui Wei et al., JHEP Reports, 2021 ）

概念验证：基因修复后的iPSC来源肝细胞治疗肝豆状核变性

病因

Disease mechanism

P型铜转运ATP酶 (ATP7B) 在肝细胞内有2个功能（图1）：①装载铜到铜蓝蛋白（Cp）形成Cp-Cu复合物，随后铜随铜蓝蛋白经循环系统输送到全身各个器官完成必要的生理功能。②将肝脏内多余的铜通过囊泡运输转运至胆汁排出体外。

肝豆状核变性 (WD)病人由于P型铜转运ATP酶 (ATP7B)发生突变，ATP酶功能减弱或缺失，血清中铜蓝蛋白合成减少，胆道排铜受阻，进而导致过量的铜无法排出并在肝脏中积聚。过量铜可产生氧自由基，使肝细胞受损，破坏，凋亡，从而导致进行性肝硬化和肝衰竭。过量的铜可导致多脏器受累，如锥体外系症状、精神症状、肾损害、Kayser-Fleischer环等。¹

图1 Copper Metabolism and ATP7B

（Aftab Ala et al., The lancet, 2007）

WD在世界范围的发病率为1/30,000 – 1/100,000，致病基因携带者约为1/90，以儿童和青少年发病为主，是常见的遗传性肝病之一。该病进入了2018年6月国家卫健委联合科技部及药品监督管理局等5家单位公布的《第一批罕见病目录》。这意味着开发WD创新药品和疗法具有
优先审评审批、减免临床试验、有条件批准上市、延长数据保护期等政策优势。

诊断和治疗

Diagnosis and Treatment

WD的实验室检测包括血清铜蓝蛋白、血清铜、尿铜和肝铜的测定，但直接检测ATP7B突变更为可靠，有助于区分携带者和患病的年轻人。
²

目前针对WD的药物主要分为2种，铜螯合剂或阻止铜吸收的锌剂（表1）。尽管铜螯合剂和锌剂治疗WD目前已取得了很不错的成效，但是其副作用也不容忽视，³有1/3的WD病人对这两类药物无应答。⁴ 因此，亟需开发高效低毒的新型疗法。目前已有多种疗法在开发过程中（表2），包括中药单体，小分子化合物，基因疗法等。

近年来，iPSC技术的蓬勃发展为这类遗传疾病也提供了新的治疗思路。

▵ 表1 现有治疗WD的药物⁵

▵ 表2 治疗WD的潜在疗法⁵

基于iPSC的创新疗法

Cell Therapy

诱导多能干细胞（iPSC）为再生医学提供了无限可能。目前，体外培养器官仍然较为困难，但是体外培养细胞的相关技术已经非常成熟。目前已有多例基于iPSC的细胞替代疗法在临床试验中。iPSC具有无限扩增的能力，并且可以分化为成体所有细胞类型，可为再生医学提供无限细胞来源。然而，多数异体细胞移植仍然需要抑制病人免疫系统以增长外源细胞在病人体内的驻留时间，长时间的免疫抑制会给病人带来感染以及罹患肿瘤的风险。结合基因修饰技术，我们可以在获得病人自身的iPSC后，修复病人iPSC基因组中的突变，分化为疾病相关细胞类型，然后移植给病人。

为了从概念上验证该策略是否适用于肝豆状核变性，我们首先建立了病人iPSC，然后利用CRISPR/Cas9及ssODNs修复了ATP7B R778L突变(图3，图4)，并进一步将基因修复后的iPSC分化为肝脏细胞。我们证实了基因修复逆转了R778L表型，表现为恢复了ATP7B在肝细胞内的亚细胞定位，并在铜过载试验中恢复了泵铜能力。随后，我们将修复后的iPSC来源的肝脏细胞移植至
Atp7b^-/- 免疫缺陷小鼠中，发现这些细胞可显著减轻小鼠的疾病症状，并且肝损伤减轻，肝纤维化降低，肝铜含量降低。

图3. 利用CRISPR/Cas9和ssODN修复R778L突变

图4. Sanger测序确认R778L被修复（杂合）

该研究结果表明，经基因修复的肝豆状核变性患者iPSC来源的肝细胞可以逆转该病的体外和体内疾病表型。这些概念验证试验表明，从基因校正的病人 iPSC中分化而来的肝细胞可望用于肝豆状核变性和其他遗传性肝病的自体细胞替代疗法。同时，本研究也为开发肝豆状核变性体内基因治疗产品完成了前期验证。

全文链接⁶：

DOI:https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2021.100389

// 参考文献 //

1. 中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组. 肝豆状核变性的诊断与治疗指南. 中华神经外科杂志. 2008;41:566-569.

2. Fernandes J, Saudubray J-M, Van den Berghe G and Walter JH. Inborn metabolic diseases: diagnosis and treatment: Springer Science & Business Media; 2006.

3. 张舒扬，赵玉沛, 罕见病诊疗指南. 2019版, 北京: 人民卫生出版社.2019.

4. orio R, D’Ambrosi M, Marcellini M, Barbera C, Maggiore G, Zancan L, Giacchino R, Vajro P, Marazzi MG, Francavilla R, Michielutti F, Resti M, Frediani T, Pastore M, Mazzarella G, Fusco G, Cirillo F, Vegnente A, Hepatology Committee of Italian Society of Paediatric Gastroenterology H and Nutrition. Serum transaminases in children with Wilson’s disease. J Pediatr Gastroenterol

Nutr. 2004;39:331-6.

5. Jiayin Yang, PhD thesis. HKU

6. Wei R, Yang J, Cheng CW, Ho WI, Li N, Hu Y, Hong X, Fu J, Yang B, Liu Y, Jiang L, Lai WH, Au KW, Tsang WL, Tse YL, Ng KM, Esteban MA, Tse HF, CRISPR-targeted genome editing of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes for the treatment of Wilson’s disease, JHEP Reports (2021), doi: https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2021.100389.

编辑：Jianquan Zhang